FastQC는 고속 염기서열 분석(high throughput sequence) 데이터의 품질 관리를 위한 분석도구입니다. 이 프로그램은 FASTQ 형식의 서열 데이터를 읽어들여 여러 품질 관리(Qaulity Control) 검사를 수행하고 결과는 HTML 기반의 보고서로 출력합니다. FastQC는 전반적인 품질 문제에 대한 개요 정보를 제공하며, 쉽게 확인할 수 있는 요약된 그래프와 테이블을 포함합니다. FastQC는 FASTQ 형식의 파일이 입력 파일로 사용되며, 출력 결과는 리포트 html 파일과 zip 형식의 압축 파일이 생성됩니다.

Cutadapt는 NGS 시퀀싱 데이터에서 어댑터(adapter) 서열 제거, 품질이 낮은 서열 제거 등 다양한 전처리 작업을 수행하는 데 사용되는 도구입니다. 주로 서열의 3’ 말단에서 염기서열을 제거하며, 특히 RNA 시퀀싱 또는 DNA 시퀀싱 데이터에서 어댑터 제거에 빈번하게 활용됩니다. 전체 데이터의 품질을 유지하여 이후의 분석 단계에서 정확한 결과를 얻을 수 있도록 도움을 줍니다. 입력 데이터로는 fastq, fastq.gz, fq, fq.gz 확장자를 가진 파일을 사용할 수 있습니다. 출력으로는 파일 확장자 앞쪽에 ‘_trimmed’라는 문구가 붙은 fastq 파일이 생성되도록 세팅되어 있습니다. 따라서 "trimmed.fastq" 파일은 프라이머 잔여물이나 다른 불순물이 제거된 reads 파일을 나타냅니다.

Kraken2은 시퀀싱 데이터 전처리 과정을 통해 정제된 리드 데이터를 이용하여, 샘플 내에 존재하는 미생물의 구성(taxonomic composition)을 신속하게 파악하기 위한 분석 단계입니다. Kraken2는 K-mer 기반의 초고속 분류 알고리즘을 사용하여 각 리드가 어떤 생물 종 또는 상위 분류군에 속하는지를 식별합니다. 이때, 미리 구축된 참조 데이터베이스(reference database)와 입력 리드의 K-mer 정보를 비교하여 가장 높은 일치도를 갖는 계통 분류(taxonomic classification) 결과를 산출합니다.

이 과정은 어셈블리 이전에 수행되어, 샘플 별 미생물 군집의 대략적인 구성을 미리 파악하거나 오염 여부를 검증하는 품질 관리(QC) 용도로 활용됩니다.

Krona는 Kraken2와 같은 분류 도구로부터 생성된 결과를 기반으로, 각 분류군의 상대적인 비율과 계통 구조를 직관적으로 시각화하는 도구입니다. Krona는 계통 분류 결과를 다층 원형(hierarchical circular) 형태의 인터랙티브 HTML 시각화로 표현하여, 각 생물군의 비율, 서열 수, 상위·하위 관계를 한 눈에 탐색할 수 있도록 지원합니다.

생성된 HTML 결과 파일은 별도의 프로그램 설치 없이 웹 브라우저에서 직접 열어볼 수 있으며, 샘플 내 주요 미생물 군집 구성이나 잠재적 오염 여부를 시각적으로 확인하는 품질 관리(QC) 용도로 사용됩니다.

균질화(Normalization) 단계는 메타게놈 시퀀싱 데이터의 리드(read) 커버리지(coverage)를 균질화하여 어셈블리의 효율을 높이고 계산 자원을 절약하기 위한 전처리 단계입니다. 일반적으로 시퀀싱 데이터에는 특정 유전체 영역이 과도하게 많이 읽히는(high coverage) 경우가 발생하는데, 이러한 불균형은 어셈블리 과정에서 메모리 사용량 증가와 조립 품질 저하를 초래할 수 있습니다. BBNorm은 각 서열의 빈도(K-mer 빈도 기준)을 계산하여, 높은 커버리지 영역의 리드 수를 감소시키고 낮은 커버리지 영역의 서열은 유지함으로써, 데이터의 복잡도를 줄이면서 정보 손실을 최소화합니다.

이 과정은 특히 MEGAHIT 같은 대규모 메타게놈 어셈블러를 사용하기 전에 수행되며, 불필요하게 중복된 리드를 제거하여 조립 속도와 정확도를 향상시킵니다. 또한 normalization을 통해 과도하게 표현된 개체군에 의한 편향을 줄여, 상대적으로 희귀한 미생물 서열이 어셈블리에 더 균등하게 반영될도록 돕습니다.

Megahit 단계는 메타게놈 시퀀싱 데이터로부터 고품질의 contig(연속 서열)를 조립(assembly) 하는 핵심 과정입니다. 메타게놈 데이터는 다양한 생물종의 서열이 혼합되어 있어 복잡도가 매우 높으며, 이를 효율적으로 조립하기 위해서는 대용량 데이터를 빠르고 안정적으로 처리할 수 있는 알고리즘이 필요합니다. Megahit은 이러한 대규모 메타게놈 데이터를 위한 초고속 de Bruijn graph 기반 어셈블러로, 다중 K-mer 점진 확장 기법(iterative multi-k-mer strategy)을 사용하여 짧은 리드를 긴 contig으로 재구성합니다.

출력 결과로 생성되는 final.contigs.fa 파일은 이후 binning(예: MetaBAT2, MaxBin2, CONCOCT) 단계 및 refinement (예: DAS_Tool)의 입력으로 활용됩니다. 이 단계는 메타게놈 분석 파이프라인 전체의 품질과 효율을 결정하는 핵심 절차로, 전처리된 고품질 리드 입력이 MEGAHIT 조립 결과에 직접적인 영향을 미칩니다.

metaQUAST(Metagenome Assembly Quality Assessment Tool)는 복합 미생물 군집의 메타게놈 어셈블리 품질을 평가하기 위해 개발된 QUAST의 확장형 버전으로, MEGAHIT이나 metaSPAdes 등의 결과를 대상으로 합니다. 다양한 종이 혼합된 시료의 특성을 고려해 reference genome 없이도 contig 기반 통계(N50, GC%, contig 길이 분포 등)를 계산하며, 내부적으로 RefSeq 데이터베이스에서 유사 reference를 자동 탐색하는 기능이 활성화되어, contig 일부를 BLAST 검색합니다. 이 과정에서 alignment를 수행해 각 contig가 어떤 종인지 추정하고, Krona 그래프 형태의 대략적인 taxonomic 구성비를 산출합니다. 이를 통해 metaQUAST는 어셈블리의 전반적인 품질뿐만 아니라 잠재적 오염과 종 구성 정보를 함께 제공합니다.

Prodigal (Prokaryotic Dynamic Programming Gene-finding Algorithm)은 어셈블러를 통해 생성된 유전체 조립 결과(contigs 또는 scaffolds)를 입력으로 하여, 원핵생물의 유전체 내 단백질 암호화 유전자(coding DNA sequence, CDS)를 예측하는 도구입니다. Prodigal은 동적 프로그래밍 기반 알고리즘을 사용하여 염기서열 내의 ORF(Open Reading Frame)를 탐색하고 각 유전자의 위치, 방향, 시작·종결 코돈, 단백질 서열 등을 예측합니다.

Prodigal 실행 후에는 여러 형식의 결과 파일이 생성됩니다.

- 각 contig 내에서 예측된 유전자의 위치 정보(좌표)와 기본 구조(annotation feature)를 포함하는 파일 (.gff)

- 예측된 CDS의 염기서열을 FASTA 형식으로 저장한 파일 (.ffn 또는 .fna),

- 예측된 CDS를 번역(translation)하여 단백질 서열(protein sequence)로 저장한 파일(.faa)

Bowtie2는 Johns Hopkins University의 Ben Langmead와 Steven Salzberg가 개발한 플랫폼으로, 전 세계 주요 게놈 센터와 바이오인포매틱스 분야에서 서열 정렬 분야의 표준 참조로 인정받고 있는 핵심 도구입니다. 이 도구는 기존 정렬 도구들의 한계를 극복하기 위해 FM-index(Full-text Minute-space index) 기술과 BWT(Burrows-Wheeler Transform) 알고리즘을 결합한 획기적인 색인 구조를 구현하여, 인간 전체 게놈과 같은 거대한 참조 서열에서도 메모리 효율성과 검색 속도를 동시에 최적화한 혁신적 솔루션을 제공합니다. Bowtie2의 가장 큰 기술적 혁신은 갭을 허용하는 정렬(gapped alignment)과 지역 정렬(local alignment) 기능을 완벽하게 지원한다는 점입니다. 이는 ChIP-seq 분석에서 핵심적으로 중요한데, 크로마틴 면역침전 과정에서 발생할 수 있는 DNA 단편화나 시퀀싱 오류를 지능적으로 처리하면서도 multi-mapping 리드의 정확한 분류를 통해 반복 서열 영역에서의 false positive 신호를 효과적으로 차단합니다. 특히 MAPQ(Mapping Quality) 점수 계산 시스템을 통해 각 정렬의 신뢰도를 정량적으로 평가하여, 후속 MACS2 피크 호출에서 고유하게 매핑된 고신뢰도 리드만을 선별적으로 활용할 수 있게 합니다.

SAMtools는 고처리량 시퀀싱 데이터를 조작하고 분석하기 위해 설계된 다목적 도구 모음으로, 특히 SAM, BAM, CRAM 형식의 정렬 데이터를 처리하는 데 사용됩니다. 이 도구는 변이 호출, 정렬 데이터 확인, 품질 관리 등 다양한 작업에 널리 활용됩니다. SAMtools는 인덱싱, 정렬, 병합, 필터링 등 정렬 파일 처리에 필요한 다양한 기능을 지원하며, 유전체 분석 파이프라인에서 필수적인 도구입니다.SAMtools sort 명령은 SAM, BAM, CRAM 파일을 지정된 기준에 따라 정렬합니다. 기본적으로 좌표(coordinate) 기준으로 정렬하며, -n 옵션을 사용하면 쿼리 이름(query name) 기준으로 정렬합니다. 정렬 순서는 SAM 파일 헤더의 @HD 태그 내 SO 필드에 표시됩니다. 좌표 정렬은 @HD SO:coordinate, 쿼리 이름 정렬은 @HD SO:queryname으로 헤더에 기록됩니다.

좌표 정렬 (Coordinate Sorting)의 경우, 읽기는 다음과 같은 순서로 정렬됩니다:

1. 참조 시퀀스 이름(RNAME): @SQ 태그에 정의된 참조 시퀀스 사전의 순서를 따릅니다.
2. 가장 왼쪽 매핑 위치(POS): 동일한 RNAME 내에서 읽기의 시작 위치를 기준으로 정렬됩니다.
3. REVERSE 플래그: POS가 동일한 경우, 순방향 가닥(forward strand, REVERSE 플래그 0)이 역방향 가닥(reverse strand, REVERSE 플래그 1)보다 먼저 옵니다.
이후 추가적인 동점이 있는 경우, 정렬 순서는 입력 데이터의 순서를 유지할 수 있습니다.
쿼리 이름 정렬 (Query Name Sorting)의 경우, -n 옵션을 사용하며 읽기는 다음과 같은 순서로 정렬됩니다:

1. 쿼리 이름(QNAME): 자연스러운 순서(natural order)로 정렬되며, 문자열 내 숫자 부분은 수치적으로 비교됩니다 (예: "read9"는 "read10"보다 먼저).
2. READ1/READ2 플래그: 동일한 QNAME을 가진 읽기는 첫 번째 읽기(READ1, 플래그 0x40)가 두 번째 읽기(READ2, 플래그 0x80)보다 먼저 옵니다.
3. 정렬 유형: READ1/READ2가 동일한 경우, 주 정렬(primary alignment)이 먼저 오고, 그 다음 보조 정렬(supplementary alignment), 2차 정렬(secondary alignment) 순으로 정렬됩니다.
남은 동점은 입력 데이터의 원래 순서를 따릅니다. 따라서 SAMtools는 유전체 데이터를 효율적으로 처리하고 분석하는 데 중요한 역할을 하며, 특히 정렬 작업에서 sort 도구가 유용하게 사용됩니다. Bio-Express의 Whole Genome Sequencing Pipeline 분석과정에서 SAMtools sort는 SAM파일을 입력 데이터로 사용하여 BAM 파일을 출력합니다.

CONCOCT (Clustering cONtigs with COverage and ComposiTion)는 메타게놈 시퀀싱 데이터를 기반으로 조립된 contig들을 염기서열 조성(nucleotide composition)과 서열의 샘플별 coverage 패턴의 유사성을 이용해 군집화(binning)하는 도구입니다. Gaussian Mixture Model(GMM) 통계 모델을 적용하여, contig들을 잠재적인 개별 미생물 유전체 단위(bin)로 분류하며, 이를 통해 서로 다른 미생물종이 혼합된 시료로부터 배양되지 않은 미생물의 게놈을 복원할 수 있습니다. Coverage 계산에는 Bowtie2 및 SAMtools의 결과 파일이 입력으로 사용됩니다. 

MetaBAT2(Metagenome Binning with Abundance and Tetra-nucleotide frequencies 2)는 메타게놈 어셈블리 결과로부터 생성된 contig들을 염기서열 조성(tetranucleotide frequency, TNF)과 샘플별 coverage 정보를 바탕으로 자동 분류(binning)하는 도구입니다. Bayesian 확률 모델을 이용해 contig 간의 유사도를 계산하고, 동일한 유래(genome)로 추정되는 contig들을 하나의 bin으로 군집화합니다. 이를 통해 복합 미생물 군집으로부터 개별 미생물 유전체(MAG)를 재구성할 수 있습니다. MetaBAT2는 속도와 정확도가 높아 대규모 샘플의 병렬 처리에 적합하며, coverage 정보는 Bowtie2 및 SAMtools 결과 파일을 기반으로 계산됩니다.

MaxBin2(Maximum-likelihood-based Binning 2)는 메타게놈 어셈블리 결과로부터 생성된 contig들을 염기서열 조성(tetranucleotide frequency; TNF), 커버리지 정보, 그리고 단일복제 마커 유전자(single-copy marker genes; SCGs)를 활용하여 자동으로 binning하는 도구입니다. Expectation-Maximization(EM) 알고리즘 기반의 확률 모델을 통해 각 contig이 특정 bin에 속할 가능성을 추정하며, SCGs를 이용해 bin의 개수 및 품질(완전도, 오염도)을 평가합니다. 이를 통해 혼합된 미생물 군집으로부터 개별 미생물 유전체(MAG)를 재구성할 수 있습니다.

DAS Tool은 여러 binning 도구(CONCOCT, MetaBAT2, MaxBin2 등)의 결과를 통합하여 각 bin의 품질을 개선하고 중복을 제거하기 위한 통합 binning 정제(refinement) 도구입니다. 개별 binning 결과로부터 얻은 bin들을 단일 세트로 병합한 후, 각 contig의 속성과 bin 품질 지표(완전도, 오염도, SCG 존재 여부 등)를 종합적으로 평가하여 점수화(scoring)합니다. 이후 점수가 가장 높은 bin 조합을 선택함으로써, 중복된 bin을 제거하고 완전도와 정확도가 향상된 최적의 MAG 세트를 생성합니다. 

QUAST(Genome Assembly Quality Assessment Tool)는 유전체 조립 결과(assembly)의 품질을 정량적으로 평가하기 위한 표준 도구입니다. 입력된 FASTA 서열(contig/scaffold)을 기반으로 contig 수, GC 비율, N50, L50, 최대 contig 길이 등 다양한 구조적 통계를 계산합니다. Reference genome을 함께 제공하면 alignment 기반의 정확도 지표(Genome fraction, Mismatch rate, Misassembly 수 등)도 산출할 수 있다. 일반적으로 단일 생물종의 WGS나 isolate genome 분석에 사용되며, DAS Tool 이후의 MAG bin 파일처럼 reference가 불명확한 경우에는 reference-free 모드로 사용해야 합니다. 결과물은 report.txt, report.tsv, report.html 형태로 제공됩니다.

CheckM2는 유전체 또는 메타게놈 어셈블리 결과의 품질을 평가하기 위한 도구로, 단일 균주 유전체부터 메타게놈에서 추출된 MAG(Metagenome-Assembled Genome)에 이르기까지 폭넓게 적용할 수 있습니다. 인공지능(AI) 기반의 예측 모델을 활용하여 각 유전체의 완전도(completeness) 와 오염도(contamination)를 정량적으로 산출하며, 기존 CheckM이 단일복제 마커 유전자 기반의 규칙형(rule-based) 접근 방식을 사용했던 것과 달리, CheckM2는 대규모 reference 유전체 및 단백질 프로파일로 학습된 신경망 모델(Neural Network Model) 을 통해 정확도와 처리 속도를 크게 향상시켰습니다. 입력으로 FASTA 또는 단백질 서열 파일을 사용하며, 내부적으로 유전자 예측과 단백질 도메인 분석을 수행한 후 품질 지표를 계산합니다. 이를 통해 개별 유전체 및 메타게놈 bin(MAG)의 신뢰성과 품질을 효과적으로 평가할 수 있습니다.

Prokka(Rapid Prokaryotic Genome Annotation)는 세균 및 고세균 유전체를 빠르고 표준화된 방식으로 주석(annotation)하기 위한 도구입니다. FASTA 형식의 유전체 서열을 입력으로 받아, CDS(단백질 코딩 서열), tRNA, rRNA, 기타 기능적 유전자 영역을 자동 탐지하고, 내부의 단백질 데이터베이스(RefSeq, UniProt, HAMAP 등)와 비교하여 유전자 기능을 부여합니다. 다중 스레드 기반으로 빠르게 수행되며, 표준화된 GFF, GBK, FAA, FNA 등의 포맷으로 결과를 출력합니다. 이를 통해 MAG을 포함한 다양한 미생물 유전체에 대해 신속하고 일관된 주석 결과를 제공할 수 있습니다.

GTDB-Tk(Genome Taxonomy Database Toolkit)는 유전체의 계통 분류(taxonomic classification)를 수행하기 위한 도구로입니다. 완전한 유전체 어셈블리부터 메타게놈으로부터 추출된 MAG(Metagenome-Assembled Genome) 데이터까지 폭넓게 적용할 수 있습니다. GTDB에 포함된 표준화된 계통 분류 체계를 기반으로, 각 유전체의 유전적 거리와 단일복제 마커 유전자의 계통적 위치를 분석하여 분류 계층(계–문–강–목–과–속–종)을 할당합니다. 내부적으로 marker gene alignment, phylogenetic placement, classification 단계를 자동으로 수행하며, RAxML, FastANI 등의 외부 도구를 통합하여 정확하고 재현성 있는 계통 분류를 제공합니다. 이를 통해 다양한 유전체 데이터에 대해 일관되고 재현성 있는 계통 정보를 부여할 수 있습니다.